病毒滅活檢測

       病毒滅活檢測病毒是一種個(gè)體微小，結構簡(jiǎn)單，只含一種核酸（DNA或RNA），必須在活細胞內寄生并以復制方式增殖的非細胞型生物。

       病毒是一種非細胞生命形態(tài)，它由一個(gè)核酸長(cháng)鏈和蛋白質(zhì)外殼構成，病毒沒(méi)有自己的代謝機構，沒(méi)有酶系統。因此病毒離開(kāi)了宿主細胞，就成了沒(méi)有任何生命活動(dòng)、也不能獨立自我繁殖的化學(xué)物質(zhì)。它的復制、轉錄、和轉譯的能力都是在宿主細胞中進(jìn)行，當它進(jìn)入宿主細胞后，它就可以利用細胞中的物質(zhì)和能量完成生命活動(dòng)，按照它自己的核酸所包含的遺傳信息產(chǎn)生和它一樣的新一代病毒。

       病毒滅活檢測病毒是一種可以在其它生物體間傳播并感染生物體的微小生物（其實(shí)因為病毒本身不能進(jìn)行新陳代謝，所以某種程度上還不能說(shuō)病毒是生物）。有時(shí)使用“病毒”描述那些在真核生物中傳播和感染的生物；使用“噬菌體”或“吞噬體”來(lái)描述那些在原核生物間傳播的生物。

       滅菌：是指用物理或化學(xué)的方法殺滅全部微生物，包括致病和非致病微生物以及芽孢，使之達到無(wú)菌保障水平。經(jīng)過(guò)滅菌處理后，未被污染的物品，稱(chēng)無(wú)菌物品。經(jīng)過(guò)滅菌處理后，未被污染的區域，稱(chēng)為無(wú)菌區域。

       消毒：消毒是指殺死病原微生物、但不一定能殺死細菌芽孢的方法。通常用化學(xué)的方法來(lái)達到消毒的作用。用于消毒的化學(xué)藥物叫做消毒劑。

       通過(guò)上面的兩個(gè)概念你可以知道無(wú)論是細菌還是病毒在滅菌操作下都會(huì )被殺死，滅菌操作下除部分細菌的芽孢基本微生物都可以殺滅，不過(guò)也根據消毒液使用的不同或者微生物的耐受不同而效果不同。

 　　病毒滅活試驗是利用某種有代表性的活病毒及其細胞感染技術(shù)，評價(jià)各種消毒因子的病毒殺滅效果，驗證消毒因子的病毒滅活能力。

　　病毒滅活檢測，首先需要根據具體的產(chǎn)品具體的病毒滅活分析，病毒滅活效果驗證，要找專(zhuān)業(yè)可靠具備CMA資質(zhì)認證的病毒殺滅試驗檢測中心機構--廣州市微生物研究所有限公司。

       病毒殺滅效果試驗，主要適用于消毒產(chǎn)品鑒定或日常監測。用具有一定代表性的、活的病毒及其細胞感染技術(shù)，評價(jià)各種用途的消毒因子對測試病毒的殺滅效果。按此方法進(jìn)行的試驗，只是對消毒因子的滅活病毒能力的重要方面進(jìn)行驗證。

       具體的病毒殺滅試驗檢測，不同的檢測單位機構，收費標準不同。不同的病毒殺滅驗證，收費要求也會(huì )不同。本公司通過(guò)實(shí)驗室資質(zhì)認定，具備CMA及CNAS資質(zhì)認證，能夠嚴格按照病毒滅活驗證標準方法，進(jìn)行試驗檢測，出具可靠的CMA報告。

    病毒失去感染性，稱(chēng)為滅活。了解滅活的條件不僅對從患者分離病毒、防腐和消毒是必要的，而且和疫苗生產(chǎn)也有關(guān)系。病毒滅活的機理有三。

        一、破壞包膜：包膜含有脂類(lèi)物質(zhì)，因之有包膜的病毒可迅速被脂溶劑破壞，如乙醚或去氧膽酸鈉可使病毒滅活。實(shí)際上可利用病毒對脂溶劑的敏感性來(lái)檢查病毒是否有包膜。物理因子，如滲透壓改變、凍融、熱和干燥等都可引起包膜破壞。一般認為，呼吸道感染的病毒對于燥抵抗力弱，傳播主要是人間直接感染，這是因為有包膜的原故。

       二、病毒蛋白質(zhì)變性：能使蛋白質(zhì)變性的化學(xué)制劑都能使病毒滅活，加熱引起變性也是有效滅活的方法。一般說(shuō)病毒對熱抵抗力弱，60℃幾分鐘就使之感染性明顯降低，因此在分離病毒時(shí)，從患者取來(lái)的標本需低溫保存，迅速送往實(shí)驗室，長(cháng)期保存要置于-80℃以下的低溫條件。

        三、病毒核酸的損害：X線(xiàn)、γ線(xiàn)等電離輻射可切斷核酸，紫外線(xiàn)可使核苷酸鏈上相鄰的嘧啶堿基形成二聚物，而破壞病毒基因的功能。另外吖啶橙或中性紅等染料可與病毒核酸結合，暴露于光線(xiàn)之下，可使核酸分解，而使病毒滅活。

　　近年來(lái)，隨著(zhù)單抗市場(chǎng)在國內的興起，對病毒清除技術(shù)（滅活和去除）的驗證也提出了更高的要求，從最初的低pH孵育到最近幾年除病毒膜過(guò)濾技術(shù)在病毒清除方面的成熟的應用，包括層析技術(shù)也逐漸被大家重視，從而進(jìn)一步提高下游工藝對于病毒的總的對數清除率。

　　在驗證實(shí)驗中，不管是哪種病毒清除技術(shù)，都是通過(guò)人為挑戰病毒，然后采用感染力或者其他適合的分析方法來(lái)估測樣品中的病毒滴度，然后測量出該步驟的病毒對數清除率，因此選擇一種合適的病毒滅活檢測分析方法對于病毒對數清除率的計算非常重要。

　　在病毒清除驗證中，病毒的檢測分為三種情況：

　　1、根據病毒的感染性來(lái)定量病毒的滴度，有兩種方法，一稱(chēng)為病毒空斑形成實(shí)驗。二稱(chēng)作TCID50半數細胞培養物感染量實(shí)驗，這種檢測方法是以細胞培養物中產(chǎn)生細胞病變效應（Cyto-pathic Effect，CPE）為基礎的檢測手段。

　　2、定量PCR的方法，盡管空斑形成和TCID50這兩種以細胞為基礎的感染性分析被視為病毒清除研究中的估測病毒滴度的金標準，qPCR方法已經(jīng)被迅速接受為病毒清除研究中估測病毒粒子的替代和補充方法。

　　3、直接用電子顯微鏡來(lái)計數病毒數目，但是由于該方法不能區分感染性病毒顆粒與非感染性病毒顆粒，因此無(wú)法判斷病毒的感染力，主要用于細胞發(fā)酵液的病毒初始量的計算中，因此著(zhù)重介紹空斑形成實(shí)驗，TCID50實(shí)驗和qPCR三種檢測方法。

 　　一、病毒培育與滅活實(shí)驗

　　1. 實(shí)驗材料

　　實(shí)驗用病毒株，宿主細胞，細胞培養瓶與 96 孔培養板，恒溫水 浴箱，二氧化碳培養箱，層流超凈工作臺，-80℃低溫箱，二氧化碳培養箱，液氮，離心設備，移液器，細胞維持培養基，細胞*培養基，去離子水等。

　　2.實(shí)驗過(guò)程

　　病毒懸液制備：實(shí)驗組，陽(yáng)性對照組，陰性對照組。病毒培育需每日觀(guān)察細胞與宿主細胞生長(cháng)情況，接種細胞，病變收獲病毒， 每組按照特定條件設置病毒滅殺實(shí)驗驗證，并每組進(jìn)行噬斑病毒感染滴度測定。平均滅活對數值計算，評價(jià)。

       病毒滅活檢測的試驗階段：

       空氣消毒試驗分為實(shí)驗室試驗、模擬現場(chǎng)試驗與現場(chǎng)試驗，各自特點(diǎn)如下：

       (1)實(shí)驗室試驗：以測定低有效劑量為目的，采用≥1m試驗柜、液體撞擊式采樣器、白色葡萄球菌，試驗菌霧粒<10μm，試驗溫度在20℃到25℃之間，相對濕度保持在50%~70%，中和劑加于采樣液中，試驗時(shí)需要自然消亡對照組，計算殺滅率結果。同一條件試驗重復3次，每次均分別計算其殺滅率。3次結果的殺滅率均≥99.90%時(shí),可判為消毒合格。

       (2)模擬現場(chǎng)試驗：以測定低有效劑量為目的，采用10m~20m實(shí)驗室、六級篩孔空氣撞擊式采樣器、白色葡萄球菌，試驗菌霧粒<10μm，試驗溫度在20℃到25℃之間，相對濕度保持在50%~70%，中和劑加于采樣培養基中，試驗時(shí)需要自然消亡對照組，計算殺滅率結果。同一條件試驗重復3次，每次均分別計算其殺滅率。3次結果的殺滅率均≥99.90%時(shí),可判為消毒合格。

       (3)現場(chǎng)試驗：以驗證實(shí)用消毒效果為目的，采用≥20m實(shí)驗室、六級篩孔空氣撞擊式采樣器、空氣中自然菌，試驗菌霧粒不定，試驗溫度和相對濕度均為自然條件，中和劑加于采樣培養基中，試驗時(shí)不需要自然消亡對照組，計算消亡率結果。試驗重復3次或以上。計算出每次的消亡率。除有特殊要求者外，對無(wú)人室內進(jìn)行的空氣消毒，每次的自然菌消亡率均≥90%者為合格。